Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Пока что мы изображали систему CRISPR/Cas9 исключительно деструктивной, расщепляющей ДНК в нужном месте. Благодаря этому ее свойству мы можем инактивировать ген. Клетки обладают механизмами выявления и починки повреждений ДНК. Такие системы репарации необходимы прежде всего для устранения дефектов, рутинно возникающих в ходе репликации ДНК, а также под действием побочных продуктов обмена веществ или физических факторов вроде ультрафиолета. Восстановлением ДНК занимаются белки, сшивающие друг с другом концы рассеченных цепей. Но при этом нередко возникают ошибки: нуклеотиды на стыке могут замениться, добавиться или выпасть. Такие ошибки часто приводят к синтезу нефункционального белка.
Природный инструментарий починки ДНК можно использовать и более конструктивно – например, для внедрения в геном новых последовательностей. Мы можем ввести в клетку фрагменты ДНК с любым желательным для нас геном. Ремонтные белки непривередливы: они сшивают любые концы ДНК, которые находят, – и с их помощью один из наших фрагментов может попасть в разрыв цепей и с обеих сторон соединиться с геномом. Возможно, вы уловите в выражении «может попасть» немало неопределенности, и будете правы: вероятностная природа микроскопического мира здесь проявляется сполна. Расщепленные Cas9 свободные концы ДНК перемещаются по законам броуновского движения. Белки, которые выявляют и чинят поврежденную ДНК, тоже блуждают. Какую пару они найдут раньше – свободный конец геномной ДНК и конец введенного в клетку фрагмента либо два свободных конца генома, – зависит от траектории их случайных перемещений, хотя мы и можем влиять на результат введением в клетку множества копий нужного гена, и тогда белок с большей вероятностью наткнется именно на него. Cas9 между тем останется в клетке – он может опять найти свою ДНК-мишень, расщепить ее и повторять процесс снова и снова. У нас есть шанс получить желаемый результат, но нет в этом уверенности. Как и в случае старых методов, нам придется совершить много ошибок, прежде чем мы добьемся успеха. Тем не менее, если все выходит как задумано, этот метод позволяет поместить наш ген ровно в то место генома, где мы хотим его видеть.
Хотя программируемые системы CRISPR/Cas9 появились от силы 10 лет назад, ученые уже изобрели более удобные схемы внедрения генетического материала. Перспективный метод праймированного редактирования, разработанный в 2019 году группой Дэвида Лю из Института Эли и Эдит Броуд, задействует широкий спектр клеточных механизмов26. Я не буду вдаваться в детали, но по сути он сплавляет модифицированный Cas9 с обратной транскриптазой – белком, формирующим ДНК на матрице РНК (см. главу 13), – и включает в РНК-гид ту самую матрицу для внедряемой, измененной по сравнению с геномной последовательности ДНК. Химера из Cas9 и обратной транскриптазы узнает и разрезает в нужном месте одну из цепей геномной ДНК, а затем в месте разреза синтезирует по матрице гидовой РНК новую ДНК, уже с желаемыми изменениями. Лишний фрагмент старой цепи должны отрезать клеточные ферменты. Рисунок дает общее представление об этом многоэтапном процессе [68]: ДНК обозначена черным, РНК – серым, на измененную последовательность указывают стрелки; белок не представлен.
Группа Лю успешно применила праймированное редактирование в клеточных культурах мыши и человека и отметила, что эта техника принципиально пригодна для исправления 89 % генетических вариантов, ассоциированных с болезнями человека. (В оставшиеся 11 % входят, например, множественные копии генов, с которыми не справиться простым переписыванием участка ДНК.)
В этой искусной подгонке ДНК с помощью иголок и ниток – белков и нуклеотидов – находит отражение физическая природа биологических молекул. ДНК – это носитель генетической информации, и чтобы изменить эту информацию, мы создаем инструменты, позволяющие нам без визуального контроля захватывать, разрезать, вставлять и сшивать ДНК-фрагменты. Точность операций поражает даже с небиологической точки зрения. Размеры некоторых деталей новейших компьютерных микросхем не превышают 10 нанометров. Длина одного нуклеотида ДНК составляет около ⅓ нанометра, но его можно контролируемо заменять с помощью праймированного редактирования и других новейших подходов.
 
Как мы узнали, активность клетки определяется не только физическим присутствием в ней какого-либо гена. Важнейшую роль играет регуляция – контроль разных этапов реализации закодированной в нем информации (см. главу 4). Ученые уже придумали, как использовать CRISPR/Cas9 для программирования регуляторных механизмов. И снова гидовая РНК этой системы служит проводником к геномным мишеням. А вот вместо стандартного белка Cas9 здесь работают его модифицированные формы, не способные расщеплять ДНК. Чтобы отключить целевой ген, лишенный нуклеазной активности Cas9 должен просто сесть в нужном месте на ДНК и помешать работе РНК-полимеразы, как это делает обычный репрессор. Такую технику использует описанный в главе 9 переключатель, который лишает бактерию возможности направленно плыть. Но гены можно и включать – например, привязывая безнуклеазный Cas9 к активаторам транскрипции, которые рекрутируют РНК-полимеразу. Таким образом, благодаря CRISPR у нас появился удобный доступ не только к геномам, но и к их регуляторным схемам.
О томатах, T-лимфоцитах и терапии
Методы на базе CRISPR позволяют легче и изящнее изменять растения, которые тысячи лет служили мишенями генетических манипуляций. Предок помидора, который по-прежнему встречается в дикой природе, дает плоды размером с горошину. В ходе одомашнивания растения его плоды становились крупнее и питательнее – так получились знакомые нам томаты. Избирательное скрещивание позволило нам отобрать предпочтительные генетические варианты, но за традиционную селекцию мы расплачиваемся снижением генетического разнообразия и устойчивости растений к стрессам, характерной для их дикого родственника. В 2018 году ученые применили систему CRISPR/Cas9, чтобы встроить в геном дикого растения всего четыре гена одомашненных томатов27. В результате оно дало плоды массой втрое больше обычной. Точность CRISPR не только бережет целостность генома, но и не допускает переноса потенциально нежелательных сцепленных генов – побочного эффекта традиционной селекции (мы видели похожее сцепление у арбуза).
Но, разумеется, больше всего нас заботит собственный организм. Медицинские подходы на базе генетического редактирования разрабатывают и внедряют с головокружительной быстротой. Эти техники не только приносят пользу, но и проливают свет на тонкости практического применения редактирующих инструментов. Чтобы системы CRISPR/Cas9 могли вырезать и вставлять фрагменты генома, эти молекулярные машины должны попадать внутрь клеток, которые мы хотим модифицировать. Лучше всего с этой задачей справляются вирусы, специально доработанные для переноса ДНК, которая кодирует белок Cas9 и необходимые последовательности РНК. Вирусы автоматически распознают клетки-мишени, прикрепляются к ним и затем проникают внутрь.
Но направить вирусы только в нужные нам клетки очень сложно. Одно из решений – извлекать целевые клетки из организма, редактировать их и помещать обратно. В 2015 году, например, ученые из Пенсильванского университета отбирали клетки крови и циркулирующие иммуноциты у пациентов, зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), который атакует T-лимфоциты, и возвращали их уже отредактированными28. Еще раньше ученые заметили, что мутация в гене CCR5, кодирующем мембранный белок Т-лимфоцитов, может защищать от ВИЧ-инфекции [69]. Пенсильванская группа повредила в извлеченных Т-клетках CCR5 и ввела их в кровоток тех же пациентов. Улучшение здоровья после процедуры оказалось незначительным, но метод зарекомендовал себя как безопасный и убедил несколько научных коллективов продолжить разрабатывать это терапевтическое направление. Еще один новаторский эксперимент 2015 года тоже задействовал иммунные клетки, на этот раз взятые у донора: их отредактировали, чтобы сделать устойчивыми к противораковым препаратам, и ввели в организм годовалой девочки, которая страдала лейкозом, не отвечающим на другие методы лечения29. Как правило, донорские иммуноциты провоцируют мощный и потенциально смертельный иммунный ответ у реципиента, если подходят ему не идеально. В этом же эксперименте редактирование предполагало и отключение генов, запускающих такой ответ. Организм ребенка принял модифицированные клетки спокойно, и лейкоз перешел в стадию ремиссии.